**印迹的基本原理、实验步骤

**印迹的基本原理、实验步骤

Western Blot原理

       Western Blot（**印迹）采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。SDS-PAGE可对蛋白质样品进行分离，转移到固相载体——例如硝酸纤维素薄膜（NC）上。固相载体可以吸附蛋白质，并保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。转移后的NC膜就称为一个印迹（blot），用蛋白溶液（如5%BSA或脱脂奶粉溶液）处理，封闭NC膜上的疏水结合位点。用目标蛋白的抗体（一抗）处理NC膜——只有待研究的蛋白质才能与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，这样清洗除去未结合的一抗后，只有在目标蛋白的位置上结合着一抗。用一抗处理过的NC膜再用标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体，如一抗是从鼠中获得的，则二抗就是抗鼠IgG的抗体。处理后，带有标记的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。
       Western Blot实验试剂及仪器
       1.试剂准备
      （1）甲醇
      （2）转移缓冲液（Tris5.8g 甘氨酸2.9g  SDS 0.37g 甲醇200ml  V=1L）
      （3）一抗，二抗
      （4）PBST，PBS，Tween-20
      （5）显影液（5X）：
       自来水（加热至 50℃） 375ml （以下药品加到温水中）
       米吐尔 1.55g， 亚硫酸钠（无水） 22.5g， 碳酸钠（无水） 33.75g， 溴化钾 20.95g，补水至 500ml
      （6）定影液：
       自来水（50～60℃） 700ml （以下药品按顺序加入前者溶解后再加后者）
       硫代硫酸钠 240g， 亚硫酸钠（无水） 15g， 冰乙酸 12.6ml，硼酸 7.5g，钾明矾 15g（水温冷至 30℃以下时再加入），加水定容至 1000ml，室温保存
       2. 材料准备
       转膜用的夹子，两块海绵垫，一支滴管，两张滤纸，一张PVDF膜，转膜槽，转移电泳仪，摇床，计时器，磁力搅拌器，转子，Western blot 盒，一块SDS-PAGE胶，脱脂奶粉
       实验步骤

       1.将玻璃板洗净，*后用ddH2O冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干。 
       2.分离胶及浓缩胶均可事先配好（除AP及TEMED外），过滤后作为储存液避光存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡），加入10%AP及TEMED即可。 
       3.封胶：灌入2/3的分离胶后应立即封胶，胶浓度＜10%时可用0.1%的SDS封，浓度＞10%时用异丁醇或异戊醇，也可以用0.1%的SDS，封胶后静置至胶凝固。待胶凝后将封胶液倒掉，如用醇封胶需用大量清水及ddH2O冲洗干净，然后加少量0.1%的SDS，目的是通过降低张力**残留水滴。
       4.灌好浓缩胶后1h拔除梳子，注意在拔除梳子时防止气泡进入梳孔使梳孔变形。拨出梳子后用ddH2O冲洗胶孔两遍以去除残胶，随后用0.1%的SDS封胶。若上样孔有变形，可用适当粗细的针头拨正。30min后上样，长时间有利于胶结构的形成，因为肉眼观的胶凝时其内部分子的排列尚未完成。(10%的AP*好现配现用，如在4℃存放勿超过两周。30%的丙烯酰胺如有沉淀，*好弃掉) 

       (二) 样品处理 
       培养的细胞（定性）  
       1.去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。 
       2.对于6孔板来说每孔加200~300uL，60~80℃的1×loading buffer。 
       3.刮下的细胞在EP管中煮沸10min，期间vortex 2~3次。 
       4.用干净的针尖挑丝，将团块弃掉，如果没有团块但有拉丝现象，可将EP管置于0℃后在14000~16000g离心2min，再次挑丝。若无团块也无丝状物但溶液有些粘稠，可使用1ml注射器反复抽吸来降低溶液粘滞度，便于上样。 
       5.待样品恢复到室温后上样。 
 
        培养的细胞（定量）  
       1.去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。 
       2.加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min。 
       3.刮下的细胞收集在EP管后超声（100~200w）3s，2次。 
       4.12000g离心，4℃，2min。 
       5.取少量上清进行定量。 
       6.将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loading buffer后直接上样*好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上样前98℃，3min。 
       3. 组织  
       1.心肝脾肾等组织可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml裂解液。可手动或电动匀浆。注意尽量保持低温，快速匀浆。 
       2.12000g离心，4℃，2min。 
       3.取少量上清进行定量。 
       4.将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀加loading buffer后直接上样*好，低温储存剩余溶液（溶于1×loading buffer），每次上样前98℃，3min。 
 
       (三) SDS-PAGE电泳(不用染色)  
       使待测样品中的蛋白质按分子量大小在凝胶中分成带。关于SDS-PAGE实验操作原理及FAQ参考  

       (四) 转膜

       电泳结束前20分钟左右戴上手套开始准备  
       1、准备：转移缓冲液（Tris5.8g 甘氨酸2.9g  SDS 0.37g 甲醇200ml  V=1L）、转膜用的夹子、两块海绵垫、一支滴管、2张滤纸、一张PVDF膜。 
       2、剪切滤纸和膜时一定要戴一次性PE手套，避免手上的蛋白污染膜。转膜前，PVDF膜应在甲醇溶液中浸泡5-10秒，浸湿为止，在平衡液中平衡（甲醇的作用是固定大分子蛋白，使小分子物质易转移出去） 
       3、将转膜用的夹子、两块海绵垫、一支滴管、2张滤纸、一张PVDF膜浸泡在转移缓冲液中，然后取出SDS-PAGE胶，将浓缩胶轻轻刮去，并在胶的一角做一缺角作为标记以区分上样顺序。将胶在转膜缓冲液中浸泡5min左右，以平衡离子强度。 
       4、夹子打开平放底部黑色电极(阴极)，放一张海绵垫片，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。在海绵垫片上放置1张转移缓冲液浸泡过的滤纸，对齐，然后用一玻璃棒作滚筒以挤出所有气泡，必要时可滴加转膜液润湿。取出浸在转膜液中的凝胶平放在滤纸上，排除所有气泡。将PVDF膜置于聚丙烯酰胺凝胶上，玻棒来回擀几遍排除所有气泡，注意在膜的正面作上标记（可以将膜的一角剪去或用签字笔在膜的边角上做记号）。在膜上盖一张转移缓冲液浸泡过的滤纸，同样须确保不留气泡。*后盖上另一张海绵垫，盖上阳极板（白色），夹紧。保证对凝胶有一定压力。 
       5、将夹子放入转移槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。转膜时将转移槽放入冰水中进行。转膜过程中电转液用磁力搅拌器搅拌。一般用恒压110V转移60min。对于大分子量的蛋白（超过120KD），时间约80min。特别要注意加强降温措施。 
       (五) **学检测 
       1、 取膜，将膜正面朝上在1xPBST溶液中摇动五分钟，洗一次，移至含有封闭液（含10％脱脂奶粉的 瓶PBST 缓冲液；脱脂奶粉5g，PBST 100ml，溶解后 4℃保存。使用时，恢复室温，用量以盖过膜面即可，一次性使用。）的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1小时。注：10%脱脂牛奶的作用：用大分子物质封闭非相关的蛋白结合位点，降低非特异性结合（抗体与膜），同时也使背景色不高。PBST：T为吐温，减少非特异性吸附，不影响抗体抗原的结合。 
       2、 取出膜在1xPBST溶液中洗5分钟，摇动，洗两次，放入1xPBST缓冲液中（内含5%脱脂牛奶），同时加入一抗与二抗到缓冲液中，孵育60min。 
       3、 用1xPBST洗至少三次，5min/次 
       4、 化学发光，显影。显影液与水1:4，定影液与水1:9，发光液 
       注：显影液（5X）： 
       自来水（加热至 50℃） 375ml （以下药品加到温水中） 
       米吐尔 1.55g 
       亚硫酸钠（无水） 22.5g 
       碳酸钠（无水） 33.75g 
       溴化钾 20.95g 
       补水至 500ml 
       配制时，上述药品应逐一加入，待一种试剂溶解后，再加入后一种试剂。4℃保存。使用时用自来水稀释至 1 倍。 
       定影液： 
       自来水（50～60℃） 700ml （以下药品按顺序加入前者溶解后再加后者） 
       硫代硫酸钠 240g 
       亚硫酸钠（无水） 15g 
       冰乙酸 12.6ml 
       硼酸 7.5g 
       钾明矾 15g（水温冷至 30℃以下时再加入） 
       加水定容至 1000ml，室温保存 
       发光液：鲁米诺试剂2ml、过氧化氢1.3ml 

       5、 在暗室中，将 1×显影液（50ml）和定影液（50ml）分别到入塑料盒中；在红灯下取出 X－光片，用切纸刀剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大 25px）；打开 X-光片夹，将膜放入X-光片夹，并将发光液均匀涂抹在膜上，之后把 X－光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上 X-光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为 1min 或 5min，也可选择不同时间多次压片，以达*佳效果；曝光完成后，打开 X-光片夹，取出 X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。显影时间一般为 1～2min（20～25℃），温度过低时（低于 16℃）需适当延长显影时间；显影结束后，马上把 X-光片浸入定影液中，定影时间一般为 5～10min，以胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。

       (六) 注意事项  

       1.显影和定影需移动胶片时，尽量拿胶片一角，手指甲不要划伤胶片，否则会对结果产生影响。 

       2.一抗，二抗的孵育时间因抗体不同可做适当的调整。 
       3.转膜时滤纸与胶，胶与膜，膜与滤纸之间不能有气泡，必须用玻棒擀走。有气泡会影响转膜效果。 
       4.把 X－光片放在膜上，一旦放上，便不能移动