IHC实验步骤

标本：组织标本：石蜡切片（病理切片和组织芯片）、冰冻切片；细胞标本：组织印片、细胞爬片、细胞涂片

操作步骤：

①石蜡切片制作

1、固定：取组织，用PBS冲洗，放入4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液内固定12h

2、脱水：倒去固定液，用蒸馏水冲洗3次，再用50%酒精冲洗2次，用酒精逐级脱水，70%酒精1天，80%酒精过夜，95%酒精3h，无水酒精（Ⅰ）、（Ⅱ）各2h

3、透明：1:1无水酒精二甲苯45min，二甲苯（Ⅰ）、（Ⅱ）各30min

4、包埋：（恒温箱内进行）浸入石蜡，1:1二甲苯石蜡（58℃）45min，石蜡（Ⅰ）、（Ⅱ）、（Ⅲ）共2.5h，用石蜡（Ⅲ）包埋组织

5、切片：包埋后的组织块经修整后，用切片机切成5-7μm，的石蜡带

6、贴片：将组织石蜡块在50℃温水中展片，然后用处理干净的载玻片捞片，组织带可黏在载玻片上

（洗片：1%HCl浸泡过夜、蒸馏水冲洗、95%酒精浸泡2h后擦干 → 涂胶：防脱剂多聚赖氨酸）

7、烤片：68℃恒温箱内烤片2h

②SP三步法

1、脱蜡：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60min，或60℃恒温箱中烘烤20min，后用二甲苯（Ⅰ）、（Ⅱ）浸泡，共25min

2、水化：无水酒精（Ⅰ）、（Ⅱ）各2min，下行至95%、80%、70%酒精（Ⅰ）（Ⅱ）各2min

3、PBS冲洗2-3次，每次5min

4、阻断：3%H2O2去离子水（或80%甲醇）孵育10min，以灭活内源性过氧化物酶活性

5、PBS冲洗2-3次，每次5min

6、抗原修复：置0.01M枸橼酸缓冲液（PH 6.0）中用煮沸（95℃，15-20min），自然冷却20min以上，再用冷水冲洗缸子，加快冷却至室温

7、PBS冲洗2-3次，每次5min

8、封闭：滴加正常山羊血清封闭液，室温孵育20min，甩去多余液体

9、滴加Ⅰ抗50μl，室温静置1h，或者37℃1h，或者4℃过夜（需在37℃复温45min）

10、PBS冲洗2-3次，每次5min

11、滴加辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗40～50μl，室温静置1h，或37℃1h

12、PBS冲洗2-3次，每次5min

13、滴加SP（链霉亲和素-过氧化物酶），室温或37℃孵育30min-1h

14、PBS冲洗2-3次，每次5min

15、显色：DAB显色5-10min，在显微镜下掌握染色程度（胞浆呈棕色者判定为阳性细胞）

（显色剂的配置：在1ml水中加1滴显色剂A，摇匀，然后加1滴显色剂B，摇匀，再加1滴显色剂C，摇匀）

（A：DAB  B：H2O2 C：磷酸缓冲液）

16、自来水冲洗10分钟终止反应

17、复染：苏木精复染2min，盐酸酒精分化

18、自来水冲洗10-15min

19、常规脱水、透明、封片（用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上）、镜检

③结果分析：每张切片选择5个高倍镜视野（400X），应用图像分析系统进行定量灰度扫描后进行分析。