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细胞转染简介

细胞转染简介

细胞转染,是指将外源基因导入细胞内的一种技术。根据哺乳动物细胞蛋白表达流程,细胞培养完成后需进行细胞转染,根据不同的实验目的选择不同的转染方法。目前,常用的细胞转染方法主要分为三类途径:物理介导(电穿孔法,基因枪法、显微注射法)、化学介导(脂质体转染法、磷酸钙共沉淀法、阳离子聚合物介导法)、生物介导(病毒介导转染、原生质体转染)。


理想细胞转染方法,应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。目前实验室常用的转染方法有脂质体转染,阳离子聚合物转染和病毒转染,不同的转染方法各有利弊,针对细胞的习性和不同的实验目的可选择相对合适的转染方法。


一般来说,原代细胞转染难度是比较大的,虽然众所周知,原代细胞研究具有非常重要的生物学意义,但是转染效率低下一直是制约其发展的主要因素。


本文我们主要介绍一种常用的适用于原代细胞的转染方法:脂质体介导转染法。


---阳离子脂质体表面带正电荷,能与核酸的磷酸根通过静电作用,将DNA分子包裹入内,形成DNA脂复合物,也能被表面带负电的细胞膜吸附,再通过融合或细胞内吞进入细胞。脂质体转染适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中,其转染率较高,优于磷酸钙法。由于脂质体对细胞有一定的毒性,所以转染时间一般不超过24小时。


常用的脂质体主要有两种,Lipofectin和Lipofectamine。前者是一种阳离子脂质试剂,可与靶DNA的磷酸骨架结合形成复合物,该复合物能轻易通过细胞膜从而完成转染过程。Lipofectin可用于转染DNA、RNA和寡核苷酸至各种动物细胞,并可将DNA导入植物原生质体。Lipofectamine是一种多阳离子转染试剂,其头部具独特的精胺基团,该基团的强负电子性使Lipofectamine具有较强的转染能力。


实验步骤

(一)贴壁细胞稳定表达的转染

1. 在六孔板或35mm培养皿中接种2ml(完全培养基)约1.3×105细胞。

2. 37℃、5%CO2条件下培养细胞至50-80%丰度。

3. 在两个1.5ml离心管中准备如下溶液:

溶液A:溶1-2 μg DNA于100μl无血清培养基中

溶液B:溶2-25μl脂质体(GIBCO BRL:LIPOFECTAMINETM Reagent)于100μl无血清培养基中

4. 将上述A、B两液混合,室温下放置15-45分钟。此时可将细胞用2ml无血清培养基漂洗1-2遍。

5. 混合的A、B两液中加入0.8ml无血清培养基,混匀,平铺在漂洗过的细胞上。如果细胞对无血清耐受能力差,这一步可加入血清。但是在转染过程中不要加入***(antibiotic)。

6.37℃、5%CO2条件下培养2-24小时。

7. 加入lml培养基(含两倍于正常浓度的血清)。若血清已加入,这一步可加入lml正常的完全培养基。

8. 在转染后的18-24小时换入新鲜的完全培养基。

9.根据细胞类型及启动子的活性,在24-72小时可对基因的表达活性进行分析。

10. 在转染后的18-24小时,可将细胞按1:10传入选择培养基中进行筛选。

(二)瞬时转染

1. 用无血清、无***(antibiotic)的培养基漂洗细胞1-2遍。

2.在六孔板或35mm培养皿中接种0.8ml(无血清培养基)约2-3×106细胞。

3. 在两个1.5ml离心管中准备如下溶液:

溶液A:溶1-2μgDNA于100μl无血清培养基中

溶液B:溶2-25μl脂质体(GIBCO BRL:LIPOFECTAMINETM Reagent)无血清培养基中

4.将上述A、B两液混合,室温下放置15-45分钟。

5.将混合液加入细胞悬液中,混匀,37℃、5%CO2条件下培养2-24小时。

6.加入4ml完全培养基,37℃、5%CO2培养24-72小时.

7.倒掉培养基,蓝光激发下观察绿色荧光。

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